Ambion TaqMan PreAmp Cells-to-CT 试剂盒实现直接从有限或少量培养细胞中进行基因表达分析，而无需 RNA 纯化。该方案包括逆转录与实时荧光定量 PCR 之间的中间扩增步骤（预扩增），其间可针对多达 100 个用户选择的基因靶标富集 cDNA，无扩增偏倚。?完整、经验证的解决方案—优化的工作流程包括细胞裂解试剂、DNase、RT 试剂、PreAmp 试剂和 TaqMan 基因表达预混液? 快速、简单和便捷—样品制备仅需 7 分钟；无需繁琐的 RNA 分离? 扩展有限的样品— 将实时荧光定量 PCR 潜力提高多达 64 倍；可同时研究多达 100 个基因? 结果精确—均一扩增，不引入偏差? 稳健性能—为 10 至 100,000 个细胞进行线性化检测；结果相当于纯化的 RNA完整、经验证的解决方案TaqMan PreAmp Cells-to-CT 试剂盒采用独特的方法裂解培养细胞，同时去除基因组 DNA 并保持 RNA 完整性，含有用于 cDNA 合成的逆转录 (RT) 试剂、用于预扩增多达 100 个基因靶标的 TaqMan PreAmp 预混液和用于实时荧光定量 PCR 分析的 TaqMan 基因表达预混液。简单、便利的 7 分钟样品制备TaqMan PreAmp Cells-to-CT 试剂盒包含简单的 7 分钟样品制备程序（图 1），可与 10–100,000 个培养细胞?样品配合使用。细胞先用 PBS 清洗，再于室温下置于裂解液中裂解 5 分钟；同时进行 DNase 处理。裂解过程在加入终止液，室温孵育2分钟后被终止。裂解物现在可以在 –20°C 条件下进行逆转录或储存。由于样本直接在培养板上（96 或 384 孔）处理，样本处理、样本丢失或转移错误可能性被降至较低水平，有利于扩展有限样品。无需加热、清洗或离心；该试剂盒极大地简化了传统上耗时的劳动密集型过程，并将时间减少至 7 分钟。扩展有限的样品—将实时荧光定量 PCR 潜力提高多达 64 倍Cells-to-CT 技术与预扩增能力的集成简化了多步骤工作流程，同时显著提高（大于 60 倍）了使用珍贵样品可进行的 PCR 反应次数，并提高了使用少量样品起始量检测 mRNA 的灵敏度。用于基因表达分析的标准实时荧光定量 PCR 反应首先使用随机引物和 Oligo dT 将总 RNA 逆转录为 cDNA，然后使用基因特异性引物和探针进行实时荧光定量 PCR 反应（图 2）。使用 TaqMan PreAmp Cells-to-CT 试剂盒，进行逆转录与实时荧光定量 PCR 之间的中间扩增步骤（预扩增），其间可针对多达 100 个用户选择的基因靶标富集 cDNA，无扩增偏倚。稀释所得预扩增反应，并使用试剂盒中包含的 TaqMan 基因表达预混液作为后续单个 TaqMan 基因表达检测的起始材料。TaqMan PreAmp 工艺有效地将样品扩展达 64 倍，从而能够进行先前通过有限的样品材料无法进行的分析。结果精确—可在不引入偏倚的情况下进行同等扩增能够进行可靠和均一的预扩增，这对于通过有限样品进行的基因表达分析至关重要。尽管也可采用其他方法预扩增 RNA 或 cDNA，这些方法使用非特异性引发扩增起始材料，导致部分转录本与其他转录本之间存在扩增偏差和失准。TaqMan PreAmp 预混液随附在 TaqMan PreAmp Cells-to-CT 试剂盒之中，利用基因特异性引物预扩增 cDNA，确保无偏扩增。与100种不同的 TaqMan 基因表达测定试剂比较时，TaqMan PreAmp Cells-to-CT 试剂盒均展现出与纯化 RNA 相当的无偏预扩增。如图3所示，预扩增反应不会因 Cells-to-CT 裂解物或纯化样品引入偏差；无论源自纯化 RNA (A) 还是 Cells-to-CT 试剂盒裂解物 (B) 的预扩增和未扩增的 cDNA，≥ 92% 的测定的 CT 值均在 ?- 1.5 ΔΔ 范围内。稳健的性能 — 结果与纯化 RNA 相当TaqMan PreAmp Cells-to-CT 试剂盒的性能已经采用100种不同的 TaqMan 测定试剂、利用 Cells-to-CT 裂解物或纯化 RNA 分别在预扩增/未预扩增条件下进行了测试。如图4所示，TaqMan PreAmp Cells-to-CT 试剂盒裂解物获得的 CT 值等于（通常优于）纯化 RNA—无论是在预扩增前 (A) 还是预扩增后 (B)。高性能的 TaqMan PreAmp Cells-to-CT 试剂盒裂解物可帮助保存起始样品中的 RNA，避免因加热、转移或基质吸附造成损失。10至100,000个细胞的线性检测RNA 图谱分析工作流程每一步骤都必须稳健，能够同时分析少量或多个细胞。TaqMan PreAmp Cells-to-CT 试剂盒经过优化，可在5个数量级的细胞上样量下有效生成 10–100,000 个细胞/裂解反应的线性结果（图5）。此外，为尽可能提高灵敏度，TaqMan PreAmp Cells-to-CT 试剂盒允许至多 45% 的逆转录反应体积由样品裂解物组成。在实时荧光定量 PCR 分析前，TaqMan PreAmp Cells-to-CT 试剂盒通过逆转录反应使用的大裂解物体积，优化的逆转录反应条件和样品预扩增来达到极佳灵敏度。久经验证的性能、成熟的组合TaqMan PreAmp Cells-to-CT 试剂盒的所有成分均经过充分优化，可实现稳定可靠的性能。这有助于避免因组合单独的样品制备、逆转录、预扩增和实时荧光定量 PCR 试剂盒而引入的不确定因素。为进一步提高质量保障，TaqMan PreAmp Cells-to-CT 试剂盒采用 TaqMan 基因表达测定进行了验证。
