手把手教你用trizol提取总RNA

1、简介：

TRIzol 试剂是一种完整的即用型试剂，可从多种生物样本中分离高质量总 RNA或同时分离 RNA、DNA 和蛋白。是最常见的RNA提取方法之一。

2、原理：

TRIZOL含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。TRIzol 可连续沉淀单份样本中的 RNA、DNA和蛋白。使用 TRIzol 试剂均质化样本后，加入氯仿，使匀浆分离成透明的上层水层（含RNA）、中间相和红色下层有机层（含 DNA 和蛋白）。使用异丙醇从水层中沉淀出 RNA。使用乙醇从中间相/有机层中沉淀出 DNA。通过异丙醇沉淀从苯酚-乙醇上清液中沉淀出蛋白。洗涤沉淀出的 RNA、DNA 或蛋白以去除杂质，然后重悬以用于下游应用。

3、耗材：所有耗材都必须使用无酶无热源的产品。

4、实验步骤：

1.样本处理

（1）贴壁细胞：倒掉培养基，每10⁵ -10⁷ 个细胞直接加入0.3-0.4 mL TRIzol™试剂到培养皿中裂解细胞。 反复吹打数次以匀浆化样本

（2）悬浮细胞：离心收集细胞弃上清，每0.25 mL样本（来自动物、植物或酵母来源的5-10×10⁶ 个 细胞或1×10⁷ 个细菌）添加0.75 mL的TRIzolTM试 剂。反复吹打数次以匀浆化样本。

（3）组织样本：每50-100mg组织加入1ml TRIZOL。使用新鲜或者-80保持的组织，以免RNA降解。使用匀浆器匀浆。

2. （可选）如果样本的脂肪含量较高，请在4°C至10°C下12000×g 离心裂解5分钟，然后将透明的上清液转移至新管中。

3.室温孵育5min

4.加入氯仿，每1ml的trizol加入200ul氯仿。上下颠倒混匀

5.孵育2-3min

6.使用低温高速离心机12000 g, 4 ℃， 离心15 min。

离心后的EP管分成三层，用移液枪吸取最上层上清移到另一个新的EP管中。若三层分层不清：如离心分层结果不理想、转移中发生颠簸，等应重新离心；吸取过程中枪头触及上清液以下区域应将上清液打回，重新离心。

7 .加入异丙醇，每1ml的trizol加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静置10min至RNA充分沉淀。12000 g，4 ℃离心10min。

8.弃去上清液，用加入75% 乙醇混匀。每1ml的trizol加入1ml乙醇。7500g，4 ℃离心5 min

9.弃去上清液，干燥五到十分钟，不可完全干燥，否则沉淀可能无法溶解。

10.用无酶水20-50ul溶解RNA白色沉淀，使其重悬。重悬后的液体可以55-60℃孵育10-15min。

手残党伙伴们的福音Phasemaker™ 管：

Phasemaker分层管包含稠厚的液体聚合物胶,将上层的水相TRIzol试剂混合物与下层的有机相分层并充分分离,大大简化了上层水相中的RNA回收。Phasemaker胶可在水相和有机相间形成坚固的屏障即使分层管被振荡、跌落或撞击,仍可轻松回收水相,且无需离心，回收率提高30%